熒光分光光度計(jì)或熒光計(jì)是強(qiáng)大的分析工具。它們與紫外-可見分光光度計(jì)有相似之處，因?yàn)閮烧叨忌婕肮獗粶y試樣品中的特定分子吸收。然而，在熒光分光光度計(jì)中，由于被稱為熒光的現(xiàn)象在吸收后發(fā)出的光的強(qiáng)度被測量為波長的函數(shù)，以產(chǎn)生熒光光譜。

熒光分光光度計(jì)的基本工作原理

　　所有分子都包含許多特定于特定分子的離散能級。在分子的基態(tài)中，它的電子占據(jù)可用的最低能級。然而，當(dāng)它們從光中吸收適當(dāng)?shù)哪芰繒r(shí)，它們可以過渡到更高的水平以形成激發(fā)態(tài)。這些本質(zhì)上是不穩(wěn)定的，因此電子會(huì)自發(fā)地回落到較低的水平。在這個(gè)過程中發(fā)出的光是熒光。

　　激發(fā)的電子可以回落到各種較低的能級或直接回到基態(tài)，導(dǎo)致能量發(fā)射低于或等于入射光能。因此，熒光光譜總是出現(xiàn)在比入射光束更長的波長處。由于熒光發(fā)射發(fā)生在各個(gè)方向，但強(qiáng)度遠(yuǎn)低于入射光束，因此熒光檢測器位通過測試樣品的光束路徑。這可以防止探測器被入射光束淹沒。

充分利用熒光分光光度法

　　雖然熒光強(qiáng)度發(fā)射比紫外-可見分光光度計(jì)中的信號弱得多，但熒光計(jì)的檢測水平較低。這是因?yàn)闊晒庑盘柺侵苯訙y量的。這與入射光束是分開的，并且可以很容易地以低噪聲貢獻(xiàn)被放大。然而，在紫外-可見分光光度計(jì)中檢測低濃度意味著測量大傳輸信號和原始入射光束之間的非常小的差異，這受到兩個(gè)光束中存在的噪聲的限制。

　　熒光計(jì)可以提供多種不同的測量選項(xiàng)：

　　高強(qiáng)度光源，一般覆蓋200~750 nm 波長范圍，配備基于衍射光柵的單色儀，因此可以將入射光束的波長調(diào)整到特定值。這意味著可以使用不同的激發(fā)能量來確定測試樣品中多種成分的濃度。

　　通過測量隨時(shí)間變化的熒光強(qiáng)度，可以計(jì)算出樣品池中發(fā)生的反應(yīng)速率

　　在掃描入射光的波長時(shí)記錄一系列熒光光譜，可以建立 3 維掃描或激發(fā)發(fā)射矩陣，其中發(fā)射的熒光強(qiáng)度取決于激發(fā)和發(fā)射波長。這會(huì)生成一個(gè)熒光指紋可用于測量樣品的成分、濃度和環(huán)境負(fù)荷，用于檢查純度、原料異常、混合物成分、有機(jī)降解引起的新鮮度或確定原產(chǎn)地等。